Hamowanie sygnalizacji Na/K-ATPazy w adipocytach ograniczało rozwój miażdżycy u myszy

Zahamowanie szlaku sygnałowego zależnego od Na⁺/K⁺-ATPazy w adipocytach wyraźnie ograniczało rozwój zmian miażdżycowych u myszy Apoe^−/− żywionych dietą typu zachodniego. W badaniu opublikowanym w Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology powierzchnia blaszki miażdżycowej była mniejsza o 67% w łuku aorty i o 48% w zatoce aorty. Wyniki wskazują na potencjalnie istotną rolę komunikacji między tkanką tłuszczową a ścianą naczyniową, ale dotyczą modelu zwierzęcego i nie oznaczają jeszcze opracowania terapii możliwej do zastosowania u pacjentów.

W artykule:

• Dlaczego badacze zainteresowali się sygnalizacją Na⁺/K⁺-ATPazy w adipocytach?
• Jak zaprojektowano eksperyment na myszach Apoe^−/−?
• Jak zmieniło się obciążenie blaszką miażdżycową?
• Wpływ na zapalenie, stres oksydacyjny i metabolizm
• Co wyniki mówią o związku tkanki tłuszczowej z miażdżycą?
• Dlaczego wyników nie można jeszcze przenosić na leczenie ludzi?

Na+/K+-ATPaza nie tylko jako pompa jonowa

Badanie przeprowadzili naukowcy związani m.in. z Marshall University Joan C. Edwards School of Medicine, Versiti Blood Research Institute, Medical College of Wisconsin oraz University of Toledo. Wśród autorów publikacji znaleźli się Bruno S. Goncalves, Yaxin Wang, Sneha S. Pillai, Quoc Quang Luu, Hortense Triniac, Hari V. Lakhani, Muhammad A. Chaudhry, Ze Zheng, Joseph I. Shapiro, Roy L. Silverstein, Komal Sodhi i Yiliang Chen.

Punktem wyjścia była obserwacja, że dysfunkcja adipocytów – komórek tkanki tłuszczowej – wiąże się ze stresem oksydacyjnym i przewlekłym stanem zapalnym. Zjawiska te mogą oddziaływać nie tylko miejscowo na tkankę tłuszczową, lecz także ogólnoustrojowo, współtworząc środowisko sprzyjające zaburzeniom metabolicznym i miażdżycy.

Autorzy skoncentrowali się na podjednostce α1 Na⁺/K⁺-ATPazy (NKA; ang. Na/K-ATPase). Białko to jest najlepiej znane z udziału w transporcie jonów sodu i potasu przez błonę komórkową, ale pełni również funkcję elementu szlaków przekazywania sygnału. Według mechanizmu opisywanego przez autorów NKA α1 oddziałuje z kinazami z rodziny Src (SFK), a aktywacja tego układu może nasilać procesy prowadzące do stresu oksydacyjnego i odpowiedzi zapalnej.

Istotnym elementem tej sieci jest również CD36 – receptor zmiatający i transporter kwasów tłuszczowych, uczestniczący m.in. w metabolizmie lipidów. Autorzy wcześniejszych prac opisali funkcjonalny kompleks NKA-CD36. W warunkach aterogennych aktywność tego układu może sprzyjać akumulacji lipidów, wytwarzaniu reaktywnych form tlenu oraz ekspresji mediatorów prozapalnych.

NaKtide jako narzędzie do zahamowania sygnalizacji

Do zablokowania szlaku wykorzystano NaKtide – 20-aminokwasowy peptyd mimetyczny opracowany na podstawie fragmentu podjednostki α1 NKA odpowiedzialnego za oddziaływanie z kinazami Src. NaKtide wiąże się z domeną kinazową SFK i ogranicza aktywację szlaku sygnałowego zależnego od NKA.

W omawianym eksperymencie nie podawano jednak po prostu peptydu jako potencjalnego leku. Badacze zastosowali konstrukcję Adipo-NaKtide umożliwiającą ekspresję NaKtide ukierunkowaną na adipocyty przy użyciu wektora lentiwirusowego i promotora adiponektyny. Jest to bardzo istotne dla interpretacji wyników: eksperyment miał przede wszystkim odpowiedzieć na pytanie mechanistyczne, czy sygnalizacja NKA zachodząca właśnie w adipocytach może wpływać na rozwój miażdżycy.

Model Apoe−/− i 12 tygodni diety typu zachodniego

Do doświadczenia wykorzystano myszy z wyłączonym genem Apoe (Apoe^−/−), czyli model podatny na rozwój zmian miażdżycowych. Zwierzęta przez 12 tygodni otrzymywały dietę typu zachodniego (ang. Western diet, WD), a następnie oceniano rozwój miażdżycy w dwóch lokalizacjach – w łuku aorty oraz na poziomie zatoki aorty.

Powierzchnię zmian lipidowych oceniano po barwieniu Oil Red O. W przypadku łuku aorty wykonywano analizę preparatów en face, natomiast w zatoce aorty analizowano przekroje histologiczne. Dodatkowo badacze oceniali skład zmian naczyniowych, ekspresję genów związanych ze stanem zapalnym, markery stresu oksydacyjnego w tkance tłuszczowej, stężenia wybranych mediatorów zapalnych w osoczu oraz tolerancję glukozy.

Autorzy potwierdzili ekspresję NaKtide w trzewnej tkance tłuszczowej. Nie wykrywali natomiast sygnału NaKtide w badanej tkance serca. W doświadczeniach uzupełniających zastosowanie kontrolnego wektora Adipo-GFP nie powodowało istotnych zmian w obciążeniu blaszką miażdżycową, ekspresji TNF-α ani stężeniu cholesterolu w osoczu.

Znaczne ograniczenie powierzchni zmian miażdżycowych

Najważniejszy wynik dotyczył wielkości zmian miażdżycowych. U myszy otrzymujących dietę typu zachodniego zahamowanie sygnalizacji NKA w adipocytach za pomocą Adipo-NaKtide wiązało się z redukcją powierzchni blaszki o 67% w łuku aorty oraz o 48% na poziomie zatoki aorty.

W głównej analizie przeprowadzonej u samców myszy Apoe^−/− dieta typu zachodniego doprowadziła do powstania zmian zajmujących średnio 10,12 ± 1,70% powierzchni łuku aorty, podczas gdy w grupie na diecie kontrolnej było to 1,99 ± 1,00%. Ekspresja Adipo-NaKtide ograniczyła obciążenie zmianami wywołanymi dietą typu zachodniego o wspomniane 67%.

W dodatkowych doświadczeniach na samicach autorzy również obserwowali działanie ateroprotekcyjne. Szczegółowe dane dotyczące samic znalazły się jednak przede wszystkim w materiałach uzupełniających, dlatego nie należy przedstawiać całego zestawu analiz jako równorzędnie przeprowadzonego u obu płci.

Mniej makrofagów w obrębie zmian

Istotną różnicę stwierdzono również w barwieniu na CD68 – marker wykorzystywany do oceny obecności makrofagów. Obszar CD68-dodatni w zatoce aorty zmniejszył się w grupie Adipo-NaKtide o około 45% – z 7,88 ± 0,39% do 4,37 ± 0,86%.

Wynik jest zgodny z hipotezą, że sygnały pochodzące z dysfunkcyjnej tkanki tłuszczowej mogą modyfikować środowisko immunologiczne ściany naczyniowej i wpływać na gromadzenie lub aktywację komórek uczestniczących w aterogenezie.

Zmniejszenie obszaru α-SMA-dodatniego

Autorzy ocenili także barwienie na α-aktynę mięśni gładkich (α-SMA), wykorzystywaną jako marker komórek mięśni gładkich naczyń. Obszar α-SMA-dodatni w zatoce aorty zmniejszył się o około 53% – z 6,59 ± 0,69% do 3,11 ± 0,58%.

Ten wynik wymaga ostrożnej interpretacji. Komórki mięśni gładkich uczestniczą zarówno w rozwoju zmian miażdżycowych, jak i w tworzeniu elementów mogących wpływać na strukturę blaszki. Sami autorzy wskazują, że mechanizm prowadzący do zmniejszenia obszaru α-SMA-dodatniego nie został wyjaśniony i może zależeć od czynników uwalnianych przez adipocyty pod kontrolą sygnalizacji NKA. Badanie nie pozwala zatem na prosty wniosek dotyczący stabilności blaszki miażdżycowej.

Mniej stresu oksydacyjnego i zapalenia w tkance tłuszczowej

Wpływ Adipo-NaKtide nie ograniczał się do morfologii zmian w aorcie. W trzewnej tkance tłuszczowej obserwowano zahamowanie szlaku sygnałowego NKA oraz redukcję markerów stresu oksydacyjnego i procesów zapalnych.

Analizy obejmowały m.in. karbonylację białek, aktywność szlaków związanych z kinazami Src i AKT oraz ekspresję genów Cd36, Il6, Tnf i Ppargc1a. Wyniki wspierały hipotezę, że ingerencja w sygnalizację NKA zmienia fenotyp metaboliczny i zapalny adipocytów, a skutki tej zmiany mogą być widoczne także poza samą tkanką tłuszczową.

Zmiany ogólnoustrojowych mediatorów zapalnych

Różnice odnotowano również w osoczu. U samców myszy na diecie typu zachodniego średnie stężenie interleukiny 6 (IL-6) wynosiło 297,46 ± 9,32 pg/ml, natomiast po zastosowaniu Adipo-NaKtide 129,15 ± 15,10 pg/ml. Dla czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) wartości wynosiły odpowiednio 9,12 ± 0,42 pg/ml i 7,36 ± 0,40 pg/ml.

Wyraźną różnicę obserwowano również w stężeniu leptyny: 2140,08 ± 154,89 pg/ml u myszy na diecie typu zachodniego wobec 1149,11 ± 87,48 pg/ml po ekspresji Adipo-NaKtide. Autorzy opisali ponadto poprawę tolerancji glukozy. W materiale uzupełniającym podobny kierunek zmian tolerancji glukozy oraz IL-6 obserwowano u samic.

W krążeniu zmniejszyła się także względna ekspresja miR-27b-3p i miR-34a-3p – mikroRNA wiązanych przez autorów z procesami uczestniczącymi w rozwoju miażdżycy.

Tkanka tłuszczowa jako aktywny uczestnik aterogenezy

Znaczenie pracy nie polega wyłącznie na wskazaniu kolejnej cząsteczki związanej z miażdżycą. Badanie wzmacnia koncepcję, zgodnie z którą tkanka tłuszczowa nie jest jedynie magazynem energii ani biernym elementem zaburzeń metabolicznych. Adipocyty mogą poprzez sygnały endokrynne i parakrynne wpływać na zapalenie systemowe oraz biologiczne zachowanie komórek ściany naczyniowej.

W tym modelu sygnalizacja zależna od NKA może znajdować się stosunkowo wysoko w kaskadzie prowadzącej od dysfunkcji adipocytu do stresu oksydacyjnego, produkcji mediatorów zapalnych, aktywacji makrofagów i rozwoju zmian miażdżycowych.

Z klinicznego punktu widzenia koncepcja jest interesująca szczególnie w kontekście otyłości, insulinooporności i zespołu metabolicznego, w których zapalenie tkanki tłuszczowej współistnieje ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym. Autorzy wskazują, że oddziaływanie na adipocyty mogłoby w przyszłości stanowić uzupełnienie strategii ukierunkowanych na klasyczne czynniki ryzyka, w tym gospodarkę lipidową.

Na obecnym etapie jest to jednak hipoteza wymagająca dalszej weryfikacji. W badaniu nie oceniano leku przeznaczonego do stosowania u pacjentów, nie prowadzono badania klinicznego i nie ustalano skutecznej ani bezpiecznej dawki NaKtide dla człowieka. Sam eksperyment opierał się na adipocytowo swoistej ekspresji peptydu uzyskanej za pomocą wektora lentiwirusowego.

Potencjalny cel terapeutyczny, a nie gotowa terapia

Określenie NKA jako potencjalnego celu terapeutycznego należy więc rozumieć na poziomie biologii mechanistycznej. Wyniki sugerują, że zahamowanie tego szlaku w adipocytach może zmieniać przebieg aterogenezy w określonym modelu zwierzęcym. Kolejnym etapem powinno być ustalenie, czy analogiczny mechanizm ma odpowiednio duże znaczenie w ludzkiej tkance tłuszczowej i ludzkiej miażdżycy oraz czy można na niego oddziaływać w sposób wystarczająco selektywny i bezpieczny.

Najważniejsze ograniczenia badania

Jednym z ograniczeń metodologicznych wskazanych przez badaczy było wykorzystanie w głównych grupach kontrolnych myszy Apoe^−/−, którym nie podawano wektora, zamiast zwierząt otrzymujących wyłącznie kontrolny wektor lentiwirusowy. W doświadczeniach uzupełniających autorzy zastosowali jednak Adipo-GFP i nie zaobserwowali jego wpływu na wielkość zmian miażdżycowych, ekspresję TNF-α ani stężenie cholesterolu w osoczu.

Autorzy zwracają również uwagę, że choć NaKtide nie był wykrywany w sercu ani w analizowanej zatoce aorty, nie przeprowadzono pełnego badania jego ekspresji we wszystkich typach komórek naczyniowych i na całej długości układu tętniczego. Nie można zatem formalnie całkowicie wykluczyć niewielkiego bezpośredniego wpływu konstrukcji na ścianę naczynia.

Kolejną niewiadomą pozostaje dokładna natura komunikacji adipocyt-naczynie. Eksperyment wskazuje, że zmiana sygnalizacji w adipocytach wpływa na fenotyp naczyniowy, ale nie identyfikuje pojedynczego hormonu, cytokiny, metabolitu lub innego czynnika odpowiedzialnego za przenoszenie tego sygnału.

Najważniejszym ograniczeniem translacyjnym pozostaje model zwierzęcy. Wyniki uzyskane u myszy Apoe^−/− nie pozwalają określić, czy zahamowanie sygnalizacji NKA w adipocytach człowieka będzie równie silnie wpływało na rozwój miażdżycy ani czy takie postępowanie okaże się bezpieczne.

Badanie dostarcza zatem przede wszystkim danych mechanistycznych wskazujących, że sygnalizacja Na⁺/K⁺-ATPazy w adipocytach może być jednym z elementów łączących dysfunkcję tkanki tłuszczowej ze stanem zapalnym naczyń i aterogenezą. To uzasadnia dalsze badania nad tym szlakiem, ale droga od obserwacji w modelu mysim do potencjalnej interwencji klinicznej pozostaje długa.

Źródła